近期武漢生物制品研究所與國家聯(lián)合疫苗工程技術研究中心等團隊在《中國生物制品學雜志》發(fā)表關于多類型生物反應器培養(yǎng)Vero細胞制備病毒的成果比較，該研究為不同類型生物反應器培養(yǎng)Vero細胞制備病毒，以及放大培養(yǎng)提供了技術支持，為后期更大規(guī)模攪拌式生物反應器高密度貼壁細胞培養(yǎng)病毒奠定基礎。
目的：
比較攪拌式生物反應器、籃式生物反應器和搖床生物反應器培養(yǎng)Vero細胞制備柯薩奇病毒A10型(Coxsackievirus A10,CV-A10)的效果。
方法：
分別采用2L搖床生物反應器(預輻照片狀載體袋)、15L籃式生物反應器(片狀載體)和40L攪拌式生物反應器(球狀載體)培養(yǎng)Vero細胞，制備CV-A10，比較不同類型生物反應器細胞貼壁效率、營養(yǎng)代謝物質含量、細胞生長特性以及病毒滴度和抗原含量差異。
結果：
攪拌式生物反應器僅需適當攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細胞的充分混勻。攪拌式生物反應器，搖床生物反應器、籃式生物反應器均可用于Vero細胞的穩(wěn)定培養(yǎng)和CV-A10的高效制備，其中攪拌式生物反應器培養(yǎng)時間短，病毒滴度更高。
01 背景
生物反應器是模擬細胞的體內環(huán)境并在體外進行生物培養(yǎng)的系統(tǒng)，其能實現(xiàn)細胞在體外的高密度增長，高效地產(chǎn)出具有醫(yī)藥價值的酶、單抗、疫苗等目標產(chǎn)物。動物細胞無細胞壁，對剪切力非常敏感，為避免細胞損傷，通常需要對生物反應器進行一定改進，如改進攪拌槳、供氣方式、加裝輔件等，從而優(yōu)化細胞生長環(huán)境。生物反應器培養(yǎng)過程及培養(yǎng)方式具有復雜性，不同類型的生物反應器和生物反應器培養(yǎng)過程參數(shù)均會對細胞生長和病毒增殖產(chǎn)生影響。該研究基于Vero細胞和CV-A10，比較搖床生物反應器(預輻照片狀載體袋)、籃式生物反應器(片狀載體)和攪拌式生物反應器(球狀載體)培養(yǎng)Vero細胞和CV-A10的差異性，以期建立Vero細胞和CV-A10高密度、高產(chǎn)量培養(yǎng)方法，為開發(fā)包含CV-A10的HFMD多價滅活疫苗提供工藝數(shù)據(jù)支持。
02 結果
2.1不同類型生物反應器細胞貼壁效率
攪拌式生物反應器接種細胞后0.5、1.5、2.5和3.5 h，上清中游離細胞占比分別為68.33%、57.00%、48.00%和30.00%，接種細胞后3.5 h，上清中有30.00%細胞未貼附至球狀載體上面，見圖1
圖1細胞貼壁效率曲線
2.2不同類型生物反應器營養(yǎng)代謝物質含量
不同類型生物反應器細胞培養(yǎng)過程中，葡萄糖含量變化曲線基本保持一致，均呈先下降后上升趨勢。不同類型生物反應器細胞培養(yǎng)過程中，乳酸含量變化曲線基本保持一致，均呈先上升后下降趨勢，細胞培養(yǎng)第3～4天時，乳酸含量最高，見圖2。
圖2葡萄糖（A）和乳酸（B）含量變化曲線
2.3不同類型生物反應器細胞生長特性
Vero細胞在2L搖床生物反應器和40L攪拌式生物反應器的細胞生長曲線均呈S型。
2L搖床生物反應器、15L籃式生物反應器與40L 攪拌式生物反應器病毒收獲液抗原含量分別為2 899～5 341、3 932～6 086和3 322～4 262 U/mL。
2L搖床生物反應器、15L籃式生物反應器和40L 攪拌式生物反應器病毒收獲液病毒滴度分別為7.750～8.500、7.875～8.250和8.375～9.000 lg CCID50/mL。
攪拌式生物反應器培養(yǎng)時間短，病毒滴度高，這主要是因為攪拌式生物反應器僅需適當攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細胞的充分混勻。2L搖床生物反應和15L籃式生物反應器由于片狀載體傳質交換較弱，接種或細胞釋放的病毒與片狀載體內腔空隙結構生長的Vero細胞的混勻效果較差。此外，相比于球狀載體，片狀載體由于傳質效果更差，載體中殘留病毒量可能更多。球狀載體培養(yǎng)的細胞更易由于球狀載體間的相互碰撞，受感染的細胞更脆弱，病毒能更快地從感染細胞中釋放出來。
圖3C：40L攪拌式生物反應器細胞形態(tài)（× 100）
03 討論
在攪拌式生物反應器中，球狀載體貼壁120min后，貼壁效率能達到約90%。該研究中，攪拌式生物反應器培養(yǎng)時間短，病毒滴度高，攪拌式生物反應器僅需適當攪拌即能保證病毒均勻懸浮，以及與球狀載體和Vero細胞的充分混勻。此外，相比于球狀載體，片狀載體由于傳質效果更差，載體中殘留病毒量可能更多。球狀載體培養(yǎng)的細胞更易由于球狀載體間的相互碰撞，受感染的細胞更脆弱，病毒能更快地從感染細胞中釋放出來。說明攪拌式生物反應器球狀載體培養(yǎng)同樣能用于CV-A10的穩(wěn)定、高效生產(chǎn)，在未來對攪拌式生物反應器不斷地工藝優(yōu)化中，可以實現(xiàn)更好的產(chǎn)量。
該研究將進一步提高培養(yǎng)效率，加快應對突發(fā)傳染病疫苗研發(fā)的速度。Vero細胞和CV-A10在攪拌式生物反應器中的成功放大，為其在包括CV-A10的HFMD多價滅活疫苗和未來新發(fā)突發(fā)傳染病疫苗中的應用提供了數(shù)據(jù)支持。
應用攪拌式生物反應器培養(yǎng)Vero細胞是病毒制備的關鍵技術，是重要的發(fā)展方向之一。生物反應器易操控，適合規(guī)模化放大，應用攪拌式反應器球狀載體培養(yǎng)Vero細胞具有明顯優(yōu)勢。生物反應器培養(yǎng)可獲得更高的收益率，生物反應器的控制系統(tǒng)可以完成更多工作，可監(jiān)測和控制的參數(shù)數(shù)量基于生物反應器中的傳感器和控制元件數(shù)量，可以更好的進行培養(yǎng)工藝條件的篩選，優(yōu)化。工藝簡單、操作靈活，有良好的適用性；培養(yǎng)工藝容易放大，可為生物體生長和增殖提供均質的環(huán)境；產(chǎn)品質量穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)；提供較好的無菌條件，細胞生長過程中不易污染。
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本文章轉載至《中國生物制品學雜志》
DOI：10.13200/j.cnki.cjb.004309
