早期胚胎發育是生命科學領域的核心研究方向之一。胚胎從受精卵開始發育，經過基因組激活(zygotic genome activation, ZGA)、快速細胞分裂和譜系分化，最終形成囊胚，為胚胎著床及后續發育奠定基礎。在這一過程中，囊胚內三譜系的形成——內細胞團(inner cell mass, ICM)、原始內胚層(primitive endoderm, PrE)和滋養外胚層(trophectoderm, TE)——標志著胚胎命運決定的關鍵轉折點。然而，受限于胚胎樣本的稀缺性和實驗條件的限制，如何構建精準模擬早期胚胎發育的體外系統，仍是該領域亟待解決的科學難題。
2021年，北京大學杜鵬教授課題組通過抑制剪接體，首次捕獲并穩定培養了小鼠全能性干細胞(mouse totipotent blastomere-like cells,mTBLCs)(Shen et al.,2021)。與經典的多能性干細胞不同，mTBLCs能夠重現全能性卵裂球的特征，為構建從單細胞開始的分化和囊胚形成模型提供了理想的“種子細胞”。隨后，在2024年，研究團隊利用相同的策略成功獲得了人的全能性干細胞(Li et al., 2024)，為進一步探索全能性及其胚胎發育研究中的應用提供了重要工具。
基于mTBLCs的這一特性，2025年1月17日，杜鵬課題組在Cell Stem Cell雜志在線發表了題為“Mouse totipotent blastomere-like cells model embryogenesis from zygotic genome activation to post implantation”的研究論文。在這項研究中，作者進一步優化了mTBLCs培養條件，并開發了mTBLCs自發分化和單細胞起始的類囊胚形成系統，mTBLCs-類囊胚具有EPI、PrE和TE譜系，并能進一步形成著床后階段的卵圓柱胚樣結構，重現了從ZGA至囊胚形成的完整發育過程。這一突破為研究全能性、細胞命運決定以及早期胚胎形態發生提供了新的技術平臺，也為早期發育的基礎與轉化研究開辟了新的可能性。
論文截圖
圖1. 通過mTBLCs模擬小鼠早期胚胎發育的關鍵事件的模式圖
在本研究工作中，作者主要有以下發現：
1:該研究通過優化培養基(2MYCP)，顯著提高了mTBLCs的增殖速度和長期自我更新能力，主要通過加入2-DG、Minocycline、Y-27632、CHIR-99021和PlaB等因子。在此過程中，PlaB發揮了關鍵作用，通過抑制剪接驅動了從多能性向全能性的轉變，而Oct4基因的去除并未影響mTBLCs在2MYCP培養基中的自我更新能力，表明Oct4不是維持細胞全能性的必要條件。2MYCP培養基中，Wnt信號通路在mTBLCs中被激活，且Wnt信號通路與細胞周期、增殖通路的激活與mTBLCs的快速自我更新能力密切相關。進一步的實驗結果表明，抑制Wnt信號通路可顯著抑制mTBLCs的增殖，證明Wnt信號對于2MYCP培養基中mTBLCs的快速擴增至關重要，但它并不參與維持mTBLCs的全能性。
圖2. Wnt信號的激活促進了mTBLCs的快速擴增
2. mTBLCs具有獨特的表觀基因組特征，這些特征有助于其全能性維持和快速自我更新。通過ATAC-seq和CUT&Tag分析，發現mTBLCs的啟動子區域(TSS)H3K27me3和H3K9me3整體水平下降，而H3K4me3、H3K27ac和RNA Pol II標記整體水平未發生顯著變化，其表觀特征與早期胚胎的初期胚胎細胞(如2細胞階段)相似。此外，mTBLCs具有比PSCs更多的寬的H3K4me3域 (broad domain)，以及更少的二價修飾基因(bivalent gene)，且MERVL轉座子在mTBLCs中具有顯著的H3K4me3標記。Wnt信號通路的激活進一步增強了與細胞周期和增殖相關基因的H3K4me3富集，從而促進了mTBLCs的快速增殖。
圖3. mTBLCs具有類似早期卵裂球的特定表觀特征
3.本研究進一步評估了mTBLCs在體內外的分化潛力。在嵌合體實驗中，通過單細胞數據，捕獲到了EGFP標記的mTBLCs生成的13種細胞，其中包括7個胚外譜系和6個胚內譜系，證明了其在嵌合小鼠中的雙向發育潛能。此外，mTBLCs通過類胚體(EBs)和畸胎瘤實驗也都展示出了胚內外雙向分化潛能，產生了包括神經、心臟和腎臟等三胚層來源的細胞，也激活了包括經典滋養層標志基因，展示其能夠生成胚外滋養層樣譜系。總體而言，mTBLCs具有強大的雙向發育潛力，能夠分化為各種胚內外譜系，成為評估全能干細胞發育潛力的重要工具。
圖4. mTBLCs具有強大的胚內外雙向分化潛能
4.本研究利用mTBLCs建立了一個模擬胚胎著床前發育的體外分化模型，以克服現有體外分化系統的挑戰。在基礎分化培養基中培養mTBLCs約3-4天后，細胞形態發生顯著變化，形成了胚胎干細胞(ESC)、胚外內胚層干細胞(XEN)和滋養層干細胞(TSC)樣的克隆。RNA-seq分析顯示，mTBLCs在分化過程中激活了不同發育階段的基因，經歷了從早期初級基因組激活(minor ZGA)到主要基因激活(major ZGA)的轉變。免疫組化驗證了mTBLCs能夠分化為上胚層(EPI)、胚外滋養層(TE)和原始內胚層(PrE)等譜系。單細胞RNA測序揭示，mTBLCs在分化過程中產生了涵蓋2細胞、4細胞、8細胞及囊胚階段的多種細胞類型，擬時間分析顯示mTBLCs經歷了兩次命運決定，首次產生TE樣細胞和ICM/EPI樣細胞，隨后ICM/EPI樣細胞分化產生了PrE樣細胞。
研究進一步發現，在自發分化過程中，mTBLCs還產生了Zscan4+和Zscan4-兩類基因組激活樣細胞(ZLCs)。擬時間分析表明，只有Zscan4- ZLCs能夠成功分化為EPI、PrE和TE三大譜系。因此，本研究提出，主要的 ZGA調控網絡可能至少可以分為由Zscan4表達標記的兩個獨立部分。同時，Zscan4的表達可能并不是進一步干細胞命運決定所必需的。這一觀察結果也與人類TBLC的自發分化過程一致，在這一過程中，經典的ZGA標志基因(如ZSCAN4/5A、DUXA/B和TPRX1等)完全沒有被誘導表達(Li et al., 2024)。這些發現不僅進一步證實了mTBLCs的內在全能性，也為探索哺乳動物胚胎發育過程中的共性機制提供了新視角。
圖5. mTBLCs自由分化體系模擬著床前胚胎發育
5. 此外，本研究發現，在沒有任何外源性信號干預的情況下，單個mTBLC能夠經歷擴增、極化和壓實過程，最終高效率的形成結構完整的類囊胚(blastoid)。這一類囊胚結構不僅包含內細胞團、原始內胚層和滋養外胚層等胚胎樣細胞，且未見異常中間狀態的細胞，mTBLC來源的囊胚在轉錄組上與體內囊胚更為接近，三個譜系的特定標志物富集。并且類囊胚可以在體外繼續培養，發育成類似卵圓柱的后植入階段結構。也可以將類囊胚移植到假孕小鼠中，其成功植入并形成卵圓柱樣著床后胚胎結構。
圖6. mTBLCs生成類囊胚并進一步發育成著床后卵圓柱樣胚胎
綜上，本研究首次建立了基于mTBLC的自發分化和胚胎樣結構形成系統，成功模擬了胚胎早期發育的多個關鍵環節。尤其是在細胞命運決定和全能性研究領域，這一系統為理解早期胚胎發育中的細胞命運轉變提供了新的視角。此外，該研究還為胚胎發育模型的應用開辟了新的可能性，未來基于這一系統，科學家們有望深入研究胚胎發育異常的分子機制，探索病理過程，甚至為解決不孕不育等生育醫學問題提供全新解決方案。
杜鵬為該論文的通訊作者。北京大學生命科學學院博士后彭冰、北京大學前沿交叉學科研究院博士研究生王清儀、生命科學學院博士研究生張飛翔為本文的并列第一作者。北京大學生命科學學院博士后申輝參與了部分工作。該項工作得到了北京高等學校卓越青年科學家計劃、北京市自然科學基金、國家自然科學基金、國家重點研發計劃基金的支持。
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原文鏈接：
Li, S., Yang, M., Shen, H., Ding, L., Lyu, X., Lin, K., Ong, J., and Du, P. (2024). Capturing totipotency in human cells through spliceosomal repression. Cell 187, 3284-3302.e23.
Shen, H., Yang, M., Li, S., Zhang, J., Peng, B., Wang, C., Chang, Z., Ong, J., and Du, P. (2021). Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression. Cell
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